Ngày đăng: 15/03/2015, 20:46
Quy trình chuyển gen kháng sâu bệnh trên cây cải ngọt Phạm Thị Sương LỜI MỞ ĐẦU Cải ngọt là một loại rau được sử dụng rất nhiều trong đời sống bởi vì thành phần dinh dưỡng trong cải ngọt khá cao, nhất là thành phần diệp hoàng tố và vitamin K. Ngoài ra, cải xanh còn có rất nhiều vitamin A, B, C, D, chất caroten, anbumin, a-xit nicotic Những năm gần đây, an toàn thực phẩm đang là vấn đề được xã hội quan tâm. Phần lớn vụ ngộ độc đều do an toàn thực phẩm không được đảm bảo. Nhưng muốn có được thực phẩm an toàn thì từ khâu sản xuất nguyên liệu, thu hoạch cho đến giữ gìn, sơ chế và lưu thông phân phối phải tuân theo các quy trình kỹ thuật, công nghệ nhất định. Trong thực tiễn sản xuất hiện tại, nhiều nông dân lạm dụng phân hóa học và các loại nông dược nên tốn nhiều ngân sách sản xuất và gây tác động không nhỏ đến môi trường, sự phong phú sinh học và thăng bằng sinh thái bị phá vỡ. Vì thế, xây dựng một nền nông nghiệp kiên cố là một việc có ý nghĩa sách lược trong tiến trình phát triển chung của quốc gia, đặc biệt với vị trí trọng yếu của khu vực nông thôn trong sự nghiệp phát triển kinh tế xã hội của viet nam hiện tại. Khi khoa học và kỹ thuật phát triển phát triển thì một phương pháp mang lại nhiều hiệu quả là sử dụng công nghệ gen. Công nghệ gen co phép mang gen có lợi vào thực vật nhằm tạo ra những loại thực vật mang lại những tính trạng mà ta muốn mà ở đây là cây cải ngọt có mang gen kháng sâu bệnh nhằm hạn chế việc sử dụng thuốc trừ sâu … nhằm đảm bảo nguồn thực phẩm an toàn và giảm ô nhiễm môi trường. Phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens theo hướng dùng vi khuẩn để chuyển nạp tạo ra cây cải ngọt chuyển gen thỏa mãn nhu cầu hiện tại. – 1 – Quy trình chuyển gen kháng sâu bệnh trên cây cải ngọt Phạm Thị Sương I. KHÁI QUÁT VỀ CÂY CẢI NGỌT I.1. ĐẶC ĐIỂM VÀ THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG Cải ngọt thuộc họ Brassicaceae rất giàu dưỡng chất. Trong 100 g cải có chứa: 1,1 g protein; 0,2 lipit; 2,1 g cacbohidrat; 61 mg canxi; 37 mg photpho; 0,5 mg sắt; 0,01 mg caroten; 0,02 thiamin (B1); 0,04 mg ribopalavin (B2); 0,3 mg niaxin (B3); 20 mg axit ascorbic (C). Cải ngọt được nhận ra do màu lá xanh nhạt và có hoa nhỏ màu vàng và và được coi là một trong những loại rau ngon nhất trong họ cải pak choy. Chiều cao của cây từ 20 – 30 cm. Lá hình ô van mang màu xanh nhạt hoặc xanh thẫm. Cây khởi đầu có hoa khi có từ 7 đến 8 lá. Rễ chùm sâu khoảng 12 cm và có bán kính 12 cm. Đường kính chum lá khoảng từ 15 đến 45 cm. Được trồng quanh năm, vụ chính là đông xuân, thời gian sinh trưởng 35 – 45 ngày. I.2. CÔNG DỤNG CÂY CẢI NGỌT Theo Đông y, cải ngọt tính ôn, có tác dụng thông lợi trường vị, làm đỡ tức ngực, tiêu thực hạ khí có thể dùng để chữa các chứng ho, táo bón, ăn nhiều giúp cho việc phòng ngừa bệnh trĩ và ung thư ruột kết và cũng giúp chống suy nhược thần kinh, giảm đau nhức phòng chống các bệnh ung thư, tim mạch và nhiều loại bệnh khác. Cải có nhiều tác dụng rất tốt như có tác dụng ngăn ngừa ung thư gan và phối hợp điều trị bệnh ung thư và xơ cứng gan. I.3. TÌNH HÌNH RAU CẢI NGỌT HIỆN NAY Cải ngọt là rau ngắn ngày có thể trồng quanh năm, không cần vốn nhiều mà tiêu thụ dễ dàng. Tuy nhiên, cải ngọt, cải xanh lại dễ gây ngộ độc nhất cho người tiêu dùng bởi nhiều sâu bệnh hại khó trừ, thời gian sinh trưởng ngắn mà phần lớn các thuốc hóa học lại có thời gian cách ly dài trong khi thuốc vi sinh và điều hòa sinh trưởng kém tác dụng với một số sâu. Hơn nữa, nông dân hòa phân đạm tưới nhiều lần để cây sinh trưởng – 2 – Quy trình chuyển gen kháng sâu bệnh trên cây cải ngọt Phạm Thị Sương nhanh. Đó chính là nguyên nhân khiến dư lượng thuốc trừ sâu và dư lượng nitrat thường cao ở 2 mẫu mã rau này và dẫn theo tình trạng ngộ độc cho người tiêu dùng. Ngày nay, rau cải ngọt ngày càng được trồng thông dụng và cho thu nhập khá cao. Do vậy nông dân sản xuất rau đã dùng đủ mọt phương pháp để nâng cao năng xuất thực vật này. Và ứng dụng công nghệ gen là biện pháp thông minh và kiên cố. nhằm giúp cay trồng chống lại sâu bệnh mà còn đảm bảo được an toàn thực phẩm II. QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO VI KHUẨN II.1 VẬT LIỆU DÙNG ĐỂ CHUYỂN GEN II.1.1. Chủng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn gây bệnh ghẻ khối u trên cây, phát sinh ung thư, tạo ra kết quả trực tiếp tạo dựng khối u để tổng hợp ra một loại dinh dưỡng đặc biệt giúp cho vi khuẩn phát triển. Gen Agrobacterium là nhóm genus có tính chất sinh sản trong đất, gram âm, cùng họ với Rhizobium. Có bốn species đã được ghi nhận. Agrobacterium tumefaciens tạo ra khối u trong tế bào tumor chưa được phân hóa và chưa được tổ chức. một vài dòng của Agrobacterium tumefaciens không tạo khối u nhưng kích thích sự tăng trưởng của teratomas (thẻ dị thường, khác thường). tuy nhiên thực vật thuộc đơn tử diệp tỏ ra kháng so với Agrobacterium, chỉ trừ một vài loài của Asparagus. Khả năng chuyển DNA của Agrobacterium tumefaciens được sử dụng trong công nghiệp gen hiện đại. – 3 – Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. a: Dưới kính hiển vi điện tử. Plasmid pCAMBIA Quy trình chuyển gen kháng sâu bệnh trên cây cải ngọt Phạm Thị Sương I.I.3. Plasmid pCAMBIA 3301, Plasmid pUbi.cryIA(b) và Plasmid pUbi.cryIA(c) Plasmid pCAMBIA 3301 có độ dài là 12Kb chứa gen gusA và gen bar. Plasmid pUbi.cryIA(b) và Plasmid pUbi.cryIA(c) có chứa gen cryA có độ dài 4 kb ở hai đầu có vị trí cắt của enzyme hin III – 4 – Quy trình chuyển gen kháng sâu bệnh trên cây cải ngọt Phạm Thị Sương II.2. QUY TRÌNH CHUYỂN PLASMID VÀO VI KHUẨN II.2.1 Tạo plasmid Sử dụng enzyme hind III . Enzyme hind III là một loại endonuclease Cấu trúc của HindIII là khá phức tạp, và bao gồm homodimer một. Giống như endonucleases loại khác hạn chế II, được cho rằng chứa một lõi thông dụng cấu trúc bao gồm bốn β-tờ và một α-xoắn . Tiểu nhà cung cấp chứa 300 axit amin và khối lượng phân tử dự đoán là 34.950 Da. Mặc dù tầm trọng yếu của enzyme này trong sinh học phân tử và công nghệ DNA. Tuy nhiên, người ta tin rằng HindIII sử dụng một cơ chế chung của xác nhận và xúc tác của DNA được tìm thấy trong các loại enzyme như EcoRI , Bam HI , và mức BGL II . Không giống như hầu hết các endonucleases loại tài liệu hạn chế, HindIII là duy nhất ở chỗ nó hoạt động kém khi không có xúc tác khi Mg 2 +. Vị trí cắt của hind III: Hinh III cắt tại đầu hind III của chuỗi plasmid pCAMBIA 3301 và cắt plasmid pUbi.cryIA(b) và plasmid pUbi.cryIA(c) sau đó plasmid pCAMBIA 3301 đã bị cắt ở hai đầu mở ra và được xử lý bởi Alikaline phosphate để chúng không nối lại với nhau. Còn plasmid pUbi.cryIA do có hai vị trí cắt tạo ra hai đoạn 6Kb tương ứng với thân và 4Kb tương ứng với đoạn gen cryIA Sau đó tiến hành nối 2 đoạn DNA plasmid pCAMBIA 3301 12kb và đoạn gen cryIA 4kb với nhau bởi enzyme ligase ở nhiệt độ 4 o C trong 16 giờ thì tạo ra plasmid mới là plasmid pITB-CRY (Institute of Tropical Biology) – 5 – Quy trình chuyển gen kháng sâu bệnh trên cây cải ngọt Phạm Thị Sương dài 16kb. Nhân dòng vector nhờ vi khuẩn E.coli nhằm thu được lượng lớn bản sao plasmid pITB-CRY. Tế bào vi khuẩn E.coli không có khả năng biến nạp. Tế bào vi khuẩn E.coli có thể được xử lý để trở nên có khả năng tiếp nhận plasmid pITB-CRY. Hai plasmid mới vào vi khuẩn biến nạp E.coli, nhân bản E. coli và tách chiết AND trần. II.2.2 Mang plasmid vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Phương pháp sử dụng là phương pháp biến nạp. Biến nạp là hiện tượng tiếp nhận DNA trần được tách từ quá trình nhân dòng trong vi khẩn E.coli từ vào tế bào vi sinh vật với much đích khuếch đại số lượng lớn bản sao DNA Plasmid nhờ bộ máy di truyền của vi sinh vật sau đó giúp đua gen mục tiêu vào vật chủ để trổ tài tính năng của gen. quá trình được tiến hành như sau: Sau khoảng thời gian tạo được vector tái tổ hợp mang gen ngoại lai, việc tiếp theo là biến nạp nó vào tế bào vật chủ. Trong trường hợp này tế bào vật chủ thường được sử dụng là vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để khuếch đại một lượng lớn DNA plasmid tái tổ hợp dùng cho tìm hiểu này. thông thường ở nước ngoài người ta thường sử dụng phương pháp sử dụng súng bắn gen nhưng ở Việt Nam điều kiện chưa có do đó ta có thể sử dung phương pháp sốc nhiệt để mang plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Phương pháp sốc nhiệt là phương pháp lý học dựa vào nguyên lý giãn nở của màng tế bào để mang plasmid mới tạo thành vào tế bào vi khuẩn. Dùng que cấy vô trùng gạt lấy một khuẩn lạc Agrobacterium tumefaciens cho vào eppendorf có chứ dung dich biến nạp (dung dịch biến nạp được tạo thành bắng cách hòa tan plasmid mới vào 100ul nước cất) vê tròn làm cho vi khuẩn trộn đều trong dung dịch. Sau đó đạt vào ngăn đá khoảng 10 phút sau đó lấy ra cho vào nước ấm khoảng 40 o C trong khoảng – 6 – Quy trình chuyển gen kháng sâu bệnh trên cây cải ngọt Phạm Thị Sương 50 giây sau đó mang vào ủ lạnh tiếp tục nhằm gây sốc nhiệt làm cho màng tế bào vi khuẩn giãn ra plasmid chứa enzyme thiết yếu xâm nhập vào và tạo ra vi khuẩn mang gen tái tổ hợp thiết yếu. Sau đó cấy chủng này lên dung dịch thích hợp lắc đều. Quy trình có thể được mô tả bằng sơ đồ hình: – 7 – Quy trình chuyển gen kháng sâu bệnh trên cây cải ngọt Phạm Thị Sương III. QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO CÂY Quá trình chuyển gen vào cây là một quá trình phức tạp và khó thực hiện để đạt được hiệu quả cao phải làm trong điều kiện vô trùng và sử dụng cây trong phòng thử nghiệm. Cây trong ống nghiệm hoặc cây con nảy mầm từ hạt được sử dụng làm vật liệu chuyển gen và sử dụng Agrobacterium tumefaciens chứa plasmid mang gen bar, gen gus và CryIA đã tạo ra ở trên III.1. CÁCH CHUYỂN GEN VÀO CÂY CẢI NGỌT Chuẩn bị cây cải ngọt thuộc loài Brassica integrifolia L. từ hạt nảy mầm khoảng 5-6 ngày có lá mầm cuống dài 1-2 mm. hoặc cây trong nuôi cấy mô. Sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được biến nạp gen CryIA lắc qua đêm để gây nhiễm mẫu, sau đó các lá mầm được nuôi cấy trên môi trường tái sinh tạo chồi Môi trường tái sinh tạo chồi là môi trường MS bao gồm: – 2mg/l NAA – 8 – Rau cải ngọt 5 ngày tuổi Quy trình chuyển gen kháng sâu bệnh trên cây cải ngọt Phạm Thị Sương – 4mg/l BA – 3.3 mg/l AgNO 3 Trong hai ngày ( có bổ sung acetosyringone nồng độ 100µM). Sau đó rủa và diệt vi khuẩn bằng dung dịch kháng sinh 500mg/l cefotaxime trong thời gian 30 phút Sau đó chuyển mẫu sang môi trường tái sinh tạo chồi có chúa chất chọn lọc PPT và 500mg/l cefotaxime. Tiếp tục cấy chuyền 2 tuần/ lần trên cùng một loại môi trường. Sau 4-5 tuần mẫu có chồi tái sinh được chuyển qua môi trường ra rễ sau đó được mang ra ngoài môi trường. III.2. PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA CÂY CHUYỂN GEN Xác minh bằng chỉ thị gusA bằng dung dịch X-Gluc bằng cách ngâm các mảnh lá chồi nhỏ với dung dịch X-Gluc khoảng 15 giờ ở 37 o C, mẫu chuyển gen sẽ có màu xanh chàm đặ trưng, mẫu đới chứng tức không mang gen sẽ không chuyển màu. PCR gen cryIA(c) DNA thực vật được chạy PCR với cặp mồi chuyên biệt, quy trình tách DNA thực vật được thực hiện theo phương pháp của Dellaporta (1983). Các cây chuyền gen được xác minh sự dấu hiệu của gen cryIA ( c ) qua khả năng kháng sâu bằng cách thả sâu xanh Heliothis armigera lên các mẫu lá trong đĩa petri. – 9 – Quy trình chuyển gen kháng sâu bệnh trên cây cải ngọt Phạm Thị Sương III.KẾT LUẬN Thực phẩm thay đổi gen (GMF-genetically modified food) là thực phẩm mà bản thân chúng hoặc sơ chế từ các thể xác động, thực vật mang các gen tái tổ hợp được chuyển vào một cách nhân tạo nhằm phục vụ các lợi nhuận kinh tế. Nhờ sử dụng Plasmid ITB để chuyển gen tất cả chúng ta đã thu nhận cây cải ngọt chuyển gen mang gen cryIA(c) kháng sâu xanh Heliothis armigera. Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử và sinh học tất cả chúng ta có thể xác nhận được của gen này hiện diện cây cải ngọt chuyển gen và gen chuyển đã có dấu hiệu tính trạng khá rõ rệt. Thực vật chuyển gen là một thành tựu của khoa học và công nghệ, việc ứng dụng quy trình này trên nhiều loại thực vật không những mang lại giá trị kinh tế mà góp phần bảo vệ môi trường và xây dựng hệ sinh thái kiên cố. Qua đề tài ta có thể hiểu rằng quy trình chuyển gen kháng sâu bệnh vào cây cải ngọt và có thể ứng dụng vào thực tiễn mang lại hiệu quả kinh tế đảm bảo nhu cầu của thị trường mà vẫn đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng. Ứng dụng công nghệ sinh học phân tử ta đã và sẽ tạo ra được nhiều thành phẩm mới mang ý nghĩa trọng yếu đảm bảo nguồn thực phẩm sạch đảm bảo được vấn đề an ninh lương thực toàn thị trường quốc tế. Việt Nam đang từng bước tiếp cận với công nghệ gen nhằm tạo ra những thực vật có khả năng chống sâu bệnh, chống hạn, chống kim loại nặng… và việc tạo ra cây cải ngọt chuyển gen mang một ý nghĩa hết sức trọng yếu và thiết yếu. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu sách – 10 – […].. . Quy trình chuyển gen kháng sâu bệnh trên cây cải ngọt Phạm Thị Sương Trang Quan Sen Kỹ thuật ghép gen, một công nghệ hàng đầu của thế kỷ 21, Kỹ thuật ghép gen Nhà xuất bản Tổng hợp TPHCM,2011 Đỗ Năng Vinh và Ngô Xuân Bình Công nghệ sinh học đại cương Nhà xuất bản Nông nghiệp 2008 PGS.TS Đào Xuân Vinh Bài giảng Công nghệ sinh học phân tử và ứng dụng,2010 Tài liệu trên internet http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/kien-thuc-cn-sinh-hoc-cay-trongchuyen -gen- va-moi-truong-pocket-no-4-.900332.html… giảng Công nghệ sinh học phân tử và ứng dụng,2010 Tài liệu trên internet http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/kien-thuc-cn-sinh-hoc-cay-trongchuyen -gen- va-moi-truong-pocket-no-4-.900332.html http://vietsciences.free.fr/thuctap_khoahoc/thanhtuukhoahoc/thucpha mchuyengen.htm http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1118 – 11 – . chuyển gen thỏa mãn nhu cầu hiện tại. – 1 – Quy trình chuyển gen kháng sâu bệnh trên cây cải ngọt Phạm Thị Sương I. KHÁI QUÁT VỀ CÂY CẢI NGỌT I.1. ĐẶC ĐIỂM VÀ THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG Cải ngọt thuộc. Quy trình chuyển gen kháng sâu bệnh trên cây cải ngọt Phạm Thị Sương LỜI MỞ ĐẦU Cải ngọt là một loại rau được sử dụng rất nhiều trong đời sống bởi vì thành phần dinh dưỡng trong cải ngọt. mang gen tái tổ hợp thiết yếu. Sau đó cấy chủng này lên dung dịch thích hợp lắc đều. Quy trình có thể được mô tả bằng sơ đồ hình: – 7 – Quy trình chuyển gen kháng sâu bệnh trên cây cải ngọt Phạm
